هنگام تهيه و استفاده از محيط كشت بايد به نكات زير توجه شود :

• تمام محيط هاي كشت بايد واجد مواد غذايي لازم براي ميكرو گانيسم باشند .
• رطوبت موجود در محيط هاي كشت در حد مفيد و لازم براي ميكرو گانيسم باشد .
• PH محيط بايد در حد معين باشد براي باكتريوژي PH=7.5 و براي كپكها PH=5.4 است .
• مواد شيميايي كه به عنوان غذا براي ميكرو گانيسم در نظر گرفته مي شود .
• چون بعضي از تركيبات موجود در تركيبات موجود محيط كشت اثر نامطلوب بر روي يكديگر دارند ، بهتر است اين مواد جداگانه تهيه گردند به عنوان ، هيد راتهاي كربن را جداگانه تهيه و در حين آزمايش با ساير مواد تشكيل دهنده محيط كشت مخلوط نمود .
• اگر از محيط جامد (حاوي آگاز ) استفاده مي كنيد بهتر است از ذوب مجدد محيط كشت خودداري شود چرا كه در مواردي از بين رفتن فاكتور هاي رشد مي گردد .
• تمام محيط هاي كشت بايد نامگذاري شده ، تاريخ تهيه ، نوع ميكروارگانيسم كشت داده شده ، نام شخص آزمايش كننده بر روي محيط كشت نوشته شود .

انواع محيط كشت : بر3نوع است :

1/liguid    or   Broth   Media

2/Semi    Solid    Media

3/Solid   Media

محيط هاي كشت مايع و نيمه جامد در لوله تهيه مي شود ، محيط كشت جامد يا در لوله به صورت مورب يا در پليت مورد استفاده قرار مي گيرد . كه از نظر مواد غذايي تشكيل دهندة محيط كشت گروههاي مختلف محيط كشت موجود مي  باشد .

  طرز تهية محيط هاي كشت :

بايد توجه داشت كه هنگام تهيه محيط كشت بايد به دستوري كه از طرف كارخانة سازندة محيط كشت داده مي شود دقت شود در مراحل توزين دقيق ، حل كردن ، استريل نمودن و تقسيم انجام مي گردد . براي توزين كردن بهتر است از ليوانهاي كاغذي يكبار مصرف و يا كاغذ آلومينيومي استفاده نمود ، همچنين براي حلد كردن محيط كشت بايد از آب مقطر گرم و تازه استفاده نمود .

ابتدا آب مقطر مورد نياز در يك استوانة مدرج با دقت اندازه گيري مي كنيم ، نصف آب مقطر را در ارلن مايري كه دو برابر حجم آب گنجايش دارد ريخته ، پودر خشك محيط كشت به تدريج به آب اضافه نموده ، سپس بقية آب مقطر را هم مي افزائيم در حاليكه پودر را با آب مخلوط مي كنيم آب را با چرخاندن ارلن به هم زده .

استريل نمودن محيط كشت :

/1 استريل كردن توسط اتوكلاو : محيط كشت را به مدت 20-15 دقيقه در درجه حرارت /12 و فشار  در داخل اتوكلاو قرار مي گيرد .

/2 حرارت دادن نوبه اي يا تند اليزاسيون :ابتدا محيط كشت را تا c 100 به مدت 30 دقيقه حرارت داده ، سپس در دماي c 37 نگهداري نموده  ، سه روز متوالي اين كار راانجام داده در پايان اين مدت محيط كشت عاري از ميكرو گانيسم ميگردد.

/3 حرارت دادن خشك : درجه حرارت 80-60 درجه سانتيگراد به مدت 60-30 دقيقه استفاده شده به مدت 7-4 روز متوالي اين عمل را تكرار مي كنيم ، براي استريل نمودن سرم در محيط كشت مخصوص هاي ديگر استفاده مي گردد.

/4 استفاده از صافي هاي مخصوص : موادي كه با حرارت خراب مي شوند با ابن روش استريل مي گردد مانند پلاسما ، اوره و بعضي قندها .

تقسيم كردن محيط هاي كشت :

براي اين كار از دستگاه هاي اتوماتيكي استفاده مي شود كه براي جلوگيري ازآلودگي نكات زيررا بايد رعايت كرد .

/1بعد از اتو كلاو درب را نبايد يك مرتبه باز كرد ، بايد صبر كرد تا فشار پايين بيايد وگر نه فشار باعث پرتاب شدن محيط كشت به بيرون مي شود .

/2 روي ميز كار بايد استريل گردد.

/3 پليت ها و لوله ها ي استريل به طور مرتب روي ميز قرار دهيد .

/4 يك شعله با شلينگ بلند در محل كارموجود باشد .

لام هاي رنگ آميزي شماره را زير ميكرويسكپ مشاهده مي كنيم شكل هاي زير مشاده مي كنيم .

شماره 3 : پانسمان

باكتري اپتونومايسس Aptinomyes

شماره 18 : بخش اطفال هم سطح زمين

باكتري استفيل Stapl

شماره 7: بخش داخلي بالاي زمين رنگ آميزي گرم نشان دهنده با سيلهاي گرم منفي پلئومورفيك است كه بعضي ها كوتاه و خميده و بعضي ها به شكل مارپيچ ديده مي شوند.

شماره 1: بخش جراحي بالاي زمين

yeast  مخمر

شماره 6: بخش اطفال بالاي زمينRod –coccrod yest polymorph

شماره 4: زايشگاه

تجمع كوكسيهاي گرم مثبت از ويژگي هاي استافيلوكلها مي باشد .

استيفلو مخمر-ميكروكوكساي –ميكروكوكس

محيط هاي كشتي را كه هيچ گونه ميكروبي وارد آنها نشده و آلوده نمي باشد به محيط بيمارستان برده و به بخش هاي مختلف مي بريم (اطفال ؟ جراحي، داخلي، زايشگاه و .. ) و به مدت 10 دقيقه .

درب پيلت ها را باز مي گذاريم تا آلوده شوند بعد از آلوده شدن به محيط آزمايشگاه آورده و به مدت 3 روز در اينكو با تور قرار مي دهيم بعد  از سه روز نوبت به رنگ آميزي مي رسد.

طرز تهيه رنگها و روشهاي رنگ آميزي :

در رنگ آميزي بيولوژيك از هر رنگ به منظور خاصي بهره برداري مي شود .

كلارك رنگ آميزي بيولوژيك را به ترتيب زير تقسيم بندي نموده است :

-رنگ آميزي بافتهاي حيواني و بافتهاي اختصاصي، رنگ آميزي بافتهاي پيوند عصبي ، خوني ، چربي و مغز استخوان ، رنگ اميزي سيتولوژي.

رنگ آميزي Histochemistry و  بالاخره رنگ آميزي plantanato,y

در ميكروبيولوژي علاوه بر اين كه رنگها براي رنگ آميزي باكتريها، مخمرها، قارچها، و پروتوزومرئهااستفاده مي شود .

گاهي نيز در محيط كشت به عنوان مواد ممانعت كنندة انتخابي جهت باكتري هاي مشخصي به كار مي رود .

رنگهاي مورد استفاده جهت رنگ آميزي با كتريها اكثرا از موادي كه در قطران زغال سنگ موجود است ساخته مي شوند و چون سابقا رنگهاي سنتيك از مشتقات آنيلين بودند به آنها رنگهاي آنيليك مي گفتند .

امروزه از مشتقات آنيلين كمتر استفاده شده و رنگهاي ذغال سنگي جاي آنرا گرفته اند .

به طور كلي بايد بدانيم كه هسته سلولها به وسيلة رنگهاي قليايي وسيتوپلاسمشان با رنگهاي اسيدي بهتر رنگ مي شود و چون مواد هسته اي باكتريها در قسمت مركزي آن پخش شده اند معمولا براي رنگ آميزي آنها از رنگهاي قليايي استفاده مي شود .

ميزان حساسيت بعضي از رنگها كه بيشتر از سايرين است در جدول زير نشان داده شده:

نام رنگ	ميزان درصد حلاليت در 26c
	آب              (اتانول %95)
كريستال ويوله	0                                     %19
ائوزين	2/18                            44/2
فوشين قليايي	5/93                            0/26
آبي متيل	1/48                             /55
سافرانسن	3/41                            5/45

رنگ آميزي باكتريها :

جهت رنگ آميزي از 2 حالت استفاده مي شود :

1)رنگ آميزي باكتريها در حالت زنده

2)رنگ آميزي باكتريها پس از مرگ

توضيح1) رنگ آميزي باكتريها در حالت زنده يا رنگ آميزي حياتي : براي مطالعه باكتريها در حالت زنده بايد از رنگهاي حياتي كه براي زندگي آنها سميتي نداشته و زياني به آنها   نمي رساند و حتي باكتريهاي متحرك را از حركت باز نمي دارند استفاده نمود .

تعداد اين رنگهازياد نيست و شامل محلول رنگهائي مانند قرمز خنثي(5 گرم در هزار)  (بلودومتيلن %5 –1 گرم در هزار ) آبي نيل(%59 –1 گرم در هزار ) و سبز مايل (%5 –1 گرم در هزار ) مي باشد .

براي بررسي باكتريها قطره اي از شيرابة باكتري در مورد آزمايش را با يك قطره از محلول رنگ مورد نظر روي لازم تميز با يكديگر مخلوط نموده و بوسيله لامل مي پوشاند و به آزمايش ميكروسكوپي مي پردازد .

توضيح 2)رنگ آميزي باكتريها پس از مرگ :

در اين نوع رنگ آميزي بايد ابتدا به تهيه گسترش اقدام نمود و سپس بر حسب روش رنگ آميزي مورد نظر از يكي از روشهاي ذكر شده زير استفاده كرد :

تهيه گسترش :

1-لام بايد كاملا تميز و عاري از مواد چربي و ساير مواد خارجي باشد .

2-توسط آنس پلاتين استريل يك قطره آب مقطر استريل در مركز لام قرار مي دهند .

3-توسط آنس پلاتين استريل قسمتي كلمن موجود در سطح محيط كشت پشقاب پتري و يا سطح شيب دار محيط كشت  را برداشته و در آب مقطر موجود روي لام به صورت شيرابه در مي آورند  بهتر است باكتري به صورت ورقة نازك و يكنواختي روي لام پخش شود .

اگر منظور  تهيه گسترش از محيط كشت مايع باشد كافي است كه از اين محيط توسط آنس پلاتين استريل  يك قطره، در مركز لام قرار داده و آن را در سطح مورد نظر پخش نمود .

4-آنس پلاتين را سپس استريل مي كنند .

5-لام را در هواي اتاق قرار مي دهند تا خشك شود .

6-لام را با گذراندن از ميان شعله چراغ الكلي فيكس مي نمايد اگر حرارت زياد داده شود شكل باكتري تغيير مي كند .

7-مدتي صبر مي كنند تا لام سرد شود  و سپس رنگ آميزي مي نمايند .

8-اگر به جاي حرارت جهت ثبوت لام از الكل استفاده مي شود ، بايد لام رادر coplin Jar محتوي الكل متيليك براي مدت 5 دقيقه يا  در الكل اتيليك براي مدت 20 دقيقه قرار داد . ساير مواد ثابت كننده  مانند كلر و جيوه و اسيد استيك را نيز ميتوان به كار برد .

 يادآوري :

هنگام كاركردن با باكتريهاي بيماريزا از پخش شدن قطرات روي ميز كار و ايجاد آئروسل بايستي اجتناب كرد چون ممكن است ذرات آئروسل را تنفس نموده و يا اين ذرات روي دست قرار گيرند و موجب بروز عارضه اي شوند .

اگر از يك لام بيش از يك دفعه استفاده مي شود ابتدا آن را در بنز الكونيوم كلرايد Bexzalkonium chloride) ) يا ساير صد عفوني كننده ها قرار دادخه و سپس مي جوشانند و بالاخره 1-2 ساعت در آب معمولي قرار مي دهند . .

نكاتي در مورد  رنگها و روش تهيه آنها بايستي رعايت شود .

1-رنگهاي مورد  استفاده بايستي از آن دسته اي باشند كه توسط كميسيون رنگها بيولوژيك مورد تاثير قرار گرفته باشند (استاندارد باشند )

2-تمام رنگها بايستي به دقت و با ترازوي حساس وزن شوند .

3-رنگها بايستي در يك هاون سائيده شده و با افزايش تدريجي حلال به حالت محلول در آيند .

4-محلول هاي رنگ بايستي قبل از استفاده صاف شوند اما بايد قبل از صاف شدن 24 ساعت  محلول رنگ را در محل آرامي قرار داد تا ذرات معلق در آن ته نشين شوند . پس از صاف كردن رنگ اگر مجددا رسوبي در ان ظاهر شود نبايد آنرا مورد استفاده قرار داد مگر آن كه مجددا صاف شود .

5-محلولهاي رنگي را بايستي در مقادير كم و غليظ تهيه نمود زيرا اين محلولها مدت زمان زيادتري در مقايسه با محلولهاي رقيق شده بدون تغيير باقي مي مانند .

6-محلولهاي رنگي رابايستي بر چسب زد و نام و غلظت و تاريخ تهيه آن را ذكر كرد .

7-محلولهاي رنگي را بايستي دور از نور نگهداري شوند .

8-رنگها را بايستي در شيشه هاي درب دار نگهداري نمود .

روشهاي رنگ آميزي :

در اين مبحث ابتدا طرز تهيه كليه رنگهاي مورد نظر و سپس روشهاي مختلف رنگ آميزي شرح داده ميشود .

رنگ آميزي ساده جهت ديدن شكل باكتري ها:

روشهاي رنگ آميزي زير جهت مطالعه شكل ميكروارگانيسم ها استفاده مي شود . اسلايد تهيه شده بايد قبل از رنگ آميزي روي شعله فيكس شود .

رنگ آميزي گرم

رنگ آميزي گرم يكي از مهمترين و متداولترين روشهاي رنگ آميزي در  باكتري شناس است كه اولين بار توسط Dan- mark ابداع شد . اين روش تفاوت بين دو گروه از ارگانيسم ها را مشخص مي كند .

1-گروهي كه گرم مثبت ناميده مي شوند .

2-گروهي كه گرم منفي ناميده مي شوند .

با استفاده از روش رنگ آميزي گرم ميكروارگانيسم هاي گرم مثبت بنفش رنگ و ارگانيسم هاي گرم منفي قرمز رنگ مي شوند . واكنش گرم در ارتباط با خواص شيميايي و فيزيولوژيك باكتريهاست و با استفاده از رنگ آميزي گرم شناسايي آن آسانتر مي شود .

تفاوت بين باكتريهاي گرم مثبت و منفي رد واكنشهاي رنگي مربوط به تفاوتهاي ساختمان شيميايي ديواره سلولي آنها مي باشد . ديواره سلولي باكتري هاي گرم منفي در مقايسه با ديواره سلولي باكتريهاي گرم مثبت داراي ميزان زيادي پيچيده است . بر اساس گفته salton تفاوت رنگي بستگي بر در دام افتادن كمپلكس رنگي كريستال ويوله و يد در ديواره سلولي باكتري دارد حصاري در نتيجه دهيدراته شدن ديواره سلولي توسط مورد دانت در سلولهاي گرم مثبت بعد از تاثير يد ايجاد مي شود . الكل ليپور از سلولهاي گرم منفي جدا كننده بنابراين باعث افزايش قابليت نفوذ سلول شده و اين حصار قابل نفوذ مي گردد . و در نتيجه كمپلكس كريستال ويوله ويد توسط حلال چربي خارج مي گردد .

چون باكتريهاي گرم منفي بعداز شستشو با الكل بي رنگ  مي شوند در نتيجه قبل از بررسي اسمير زير ميكروسكوپ بايستي از يك رنگ متضاد استفاده كرد . معمولا سافرانين را بعنوان رنگ متضاد انتخاب مي كند در نتيجه گرم مثبتها به رنگ آبي يا بنفش و گرم منفي ها به رنگ قرمز ظاهر مي شوند روشهاي زيادي براي تكنيك رنگ آميزي گرم مورد استفاده قرار مي گيرد مانند روش Hucker رنگ آميزي اصلي  گرم (original  cran   stain) روش kopeloff روش kopeloff –Bermann و رنگ آميزي گرم براي افراد، كوررنگ كه به ترتيب اين روشها در زير شرح داده خواهند شد .

بوسيله cregersen بك روش سريع براي تشخيص گرم مثبت و گرم منفي از يكديگر ابداع شده است . زيرا گاهي در اثر رعايت نكردن زمان هاي لازم رنگ آميزي يا سنين مختلف باكتريهاي اين ارگانيسم ها رنگ اصلي خود را كسب نكرده باعث اشتباده در تشخيص مي گردد .

به خاطر اجتناب از اشتباه در رنگ آميزي گرم يا رنگ  زدايي بيشتر در اين روش ، توصيه مي شود كه حداقل روزي يك بار ارگانيسم هاي گرم مثبت و گرم منفي شناخته شده را همراه با نمونه هاي مورد آزمايش در يك زمان به عنوان كنترل رنگ آميزي نمود .

روش رنگ آميزي :

گسترش يكنواخت و نازكي از آب را روي لام تميزي پخش مي كنيم . سپس از محيط كشت هاي ميكروب مقداري بالوپ استريل بر مي داريم سپس بر روي آب پخش مي كنيم سپس بر روي حرارت گرفته تا خشك شود سپس رنگ آميزي را آغاز مي كنيم بر روي لامه آغشته به ميكروب ابتدا كريستال ويوله ريخته وزمان را به مدت يك دقيقه نگه مي داريم بعد  از آن رنگ بر ريخته و سريعا مي شوئيم سپس محلول فوشين را ميريزيم و به مدت 30 ثانيه نگه داشته مي شوئيم و لام گذاشته تا خشك شود و سپس قطره اي روغن بر روي آن ريخته و زير ميكروسكوپ نگاه مي كنيم .